La scena si rappresenta in Firenze. Mirandolina gestisce con l’aiuto del suo fedele servitore Fabrizio la locanda ereditata dal padre, dove due ospiti in particolare, il Marchese di Forlipopoli e il Conte d’Albafiorita, si prodigano nel corteggiare la bella Locandiera – l’uno fingendo una ricchezza che non ha e l’altro facendo sfoggio di una nobiltà comprata.

La donna, cui sembra bastare per il suo piacere l’attenzione che suscita negli uomini, non concede nulla a nessuno dei tre, ma ha cura di tenerne abilmente in sospeso le speranze.

L’equilibrio si spezza quando giunge alla locanda il Cavaliere di Ripafratta, acerrimo nemico delle donne che da subito dimostra il suo disprezzo trattando Mirandolina duramente sotto lo sguardo esterrefatto del Conte e del Marchese:

«Io certamente non vi è pericolo che per le donne abbia che dir con nessuno. Non le ho mai amate, non le ho mai stimate, e ho sempre creduto che sia la donna per l’uomo una infermità insopportabile».

Mirandolina, ferita nel suo orgoglio, decide di dare una lezione al Cavaliere:

«Voglio usar tutta l’arte per vincere, abbattere e conquassare quei cuori barbari e duri che son nemici di noi donne, che siamo la miglior cosa che abbia prodotto al mondo la bella madre natura».